X
تبلیغات
وبلاگ تخصصی ژنتیک و بیومتری نادر شهبازی

وبلاگ تخصصی ژنتیک و بیومتری نادر شهبازی

تعاملی با دانشجویان و فارغ التحصیلان دوره تحصیلات تکمیلی

ترجمه یا بیوسنتز انواع پروتئین

 

ترجمه یا بیوسنتز انواع پروتئین

مقدمه

پروتئینها از اتصال اسیدهای آمینه به یکدیگر از طریق پیوند پپتیدی بدست می‌آیند. تشکیل پیوند پپتیدی و قرار گرفتن ترتیب اسیدهای آمینه که برای هر پروتئین اختصاصی است، به سادگی امکان پذیر نیست. به همین دلیل می‌بایست در یاخته مکانیسم ویژه‌ای وجود داشته باشد که بتواند ویژگی پروتئینها را حفظ کند. بیوسنتز پروتئینها در واقع ترجمه ترتیب نوکلئوتیدی اسید نوکلئیک DNA در مولکول پروتئین است. انتقال اطلاعات از DNA به مولکول پروتئین بوسیله RNAها ، بویژه mRNA امکانپذیر است. بدین ترتیب برای هر پروتئین ، mRNA اختصاصی آن پروتئین وجود دارد.

به عبارت دیگر هر پروتئین در روی DNA ، ژن اختصاصی دارد که اطلاعات آن ژن در mRNA رونویسی و در مولکول ترجمه می‌شود. در بیوسنتز پروتئینهایی که در ساختارشان بیش از چند اسید آمینه دارند، وجود یک مکانیسم سنتزی که در آن ترکیبات و عوامل بسیاری دخالت می‌کنند، الزامی است. این مکانیسم به یک سیستم رمز یاب نیاز دارد که بطور خودکار واحد اسید آمینه معینی را در موقعیت ویژه‌ای از زنجیره پروتئینی قرار می‌دهد.

ترکیبات شرکت کننده در سنتز

RNA پیک (mRNA)

این RNA اطلاعات مربوط به پروتئین ویژه‌ای را از مولکول DNA می‌گیرد و به ماشین سنتز کننده پروتئین انتقال می‌دهد. در ترتیب نوکلئوتیدهای mRNA هر سه نوکلئوتید مجاور بیانگر رمز (کدون) اسید آمینه مشخص هستند و به همین جهت ترتیب نوکلئوتیدها در mRNA بیان کننده ترتیب اسیدهای آمینه در پروتئین است. هر اسید آمینه رمز مشخصی دارد. متیونین و تریپتوفان فقط یک رمز دارند، در حالیکه سایر اسیدهای آمینه واجد دو یا تعداد بیشتری رمز هستند.

رمز میتونین همیشه AUG است که آغاز سنتز را در همه پروتئینها به عهده دارد. در
یاخته‌های پروکاریوت و یوکاریوت ، در هر دو پروتئین سازی با میتونین آغاز می‌شود. پروتئینهایی که نخستین اسید آمینه آنها میتونین نیست، پس از آغاز میتونین آغازین از مولکول برداشته می‌شود. سه رمز UGA و UAA و UAG برای پروتئین رمز خوانی نمی‌کنند، بلکه رمزهایی هستند که پایان سنتز زنجیره پروتئین را بیان می‌کنند.

RNA ناقل (tRNA)

tRNA ساختار سوم از نوع L دارد که در آن دو ناحیه پذیرنده و آنتی کدون آزادند و بقیه مولکول تاب خورده است. آنتی کدون (پاد رمز) شامل سه نوکلئوتید است که مکمل رمز ویژه‌ای از mRNA است. tRNA از ناحیه پذیرنده یک اسید آمینه اختصاصی را به خود متصل می‌کند. آنزیم اختصاصی به نام آمینو اسیل- tRNA- سنتتاز این عمل را انجام می‌دهد. در نتیجه برای هر اسید آمینه دست کم یک tRNA اختصاصی وجود دارد. ولی برخی از اسیدهای آمینه بیش از یک نوع tRNA دارند.

ریبوزومها

ریبوزمها که از اتصال RNA ریبوزومی با تعدادی پروتئین شکل می‌گیرند، شامل دو زیر واحد هستند که از نظر اندازه و نوع پروتئینها در یوکاریوتها متفاوت هستند. دو زیر واحد در حالت عادی از یکدیگر جدا بوده و در یاخته پراکنده‌اند. در حالی که با آغاز سنتز پروتئین ، دو زیر واحد به هم متصل شده و یک مجموعه را تشکیل می‌دهند. در روی ریبوزومها (هر دو زیر واحد) در جایگاه وجود دارد. جایگاه آمینو اسیل که با A نمایش داده می‌شود و جایگاه پپتیدیل که با P مشخص می‌شود. هنگامی که دو زیر واحد به هم متصل می‌شوند، جایگاهها به نحوی قرار می‌گیرند که کاملا بر همدیگر منطبق باشند.

آنزیم پپتیدیل ترانسفراز یا پپتید سنتتاز

اتصال دو اسید آمینه به یکدیگر یا تشکیل پیوند پتیدی را کاتالیز می‌کند.

عوامل آغازگر

این عوامل دراز کننده و پایان دهنده یا آزاد کننده زنجیره هستند.

انرژی لازم

انرژی لازم در واکنشها بوسیله GTP تامین می‌شود.

مراحل سنتز پروتئین(مراحل سنتز در پروکاریوتها)

آغاز سنتز

عواملی که در آغاز سنتز زنجیره پروتئین شرکت دارند، عوامل آغازگر خوانده شده و با علامت اختصاصی IF نشان داده می‌شوند. تا کنون سه نوع آغازگر IF1 , IF2 , IF3 شناسایی و مطالعه شده‌اند. رمز آغازگر سنتز در روی mRNA همیشه مربوط به اسید آمینه متیونین بوده و در پروکاریوتها این اسید آمینه حالت فرمیل دار متیونین است. رمز متیونین و یا فرمیل متیونین سه نوکلئوتید AUG است. در مرحله اول ، عامل IF3 به زیر واحد کوچک ریبوزوم متصل می‌گردد.

سپس mRNA در روی آن طوری قرار می‌گیرد که رمز AUG در جایگاه P ریبوزوم واقع شود. پس از استقرار mRNA در جایگاه خود IF3 آزاد می‌گردد. در مرحله بعد عامل IF2 , GTP به tRNA فرمیل متیونین (fMet) متصل شده و مجموعا بر روی زیر واحد کوچک ریبوزوم که حامل mRNA نیز هست، انتقال می‌یابد. در این حالت زیر واحد بزرگ ریبوزوم به مجموعه فوق به نحوی متصل می‌شود که جایگاه P و A دو زیر واحد به یکدیگر منطبق شوند.

دراز شدن زنجیره

مرحله‌ای است که طی آن اسیدهای آمینه تشکیل دهنده زنجیره پروتئین مورد نظر ، یکی یکی با سوار شدن بر روی tRNA ویژه خود ، بر روی ریبوزوم انتقال می‌یابند و بین آن پیوند پپتیدی ایجاد می‌شود. در این فرآیند عوامل دراز کننده زنجیره شرکت دارند که با EFG و EFT نشان داده می‌شوند. ابتدا اسید آمینه دوم بر روی tRNA خود سوار می‌شود و عوامل GTP و EFG را به خود متصل می‌کند و مجموعه حاصل به جایگاه A ریبوزوم منتقل می‌شود. پس از اینکه tRNA کاملا در محل خود ثابت شد، EFT آزاد می‌شود و GTP به GDP و Pi تبدیل می‌گردد.

در مرحله بعد بین دو اسید آمینه که یکی در جایگاه P و دیگری در جایگاه A قرار دارد، پیوند پپتیدی تشکیل می‌شود. این عمل بوسیله آنزیم پپتیدیل ترانسفراز یا پپتیدیل سنتتاز --- کاتالیز می‌گردد. در این حالت حرکت ریبوزوم در روی mRNA در جهت 5> به 3 اندازه یک رمز ، موجب می‌شود که tRNA موجود در جایگاه p (که اسید آمینه خود را رها کرده) و tRNA پپتیدیل (که اسید آمینه را بر روی خود حمل می‌کند) از جایگاه A به P انتقال ‌یابد. این مرحله جابجایی نامیده می‌شود و انجام آن به عامل EFG نیاز دارد. جایگاه A که اکنون خالی شده ، برای پذیرش اسید آمینه سوم آماده می‌شود. اتصال واحدهای اسید آمینه به همین ترتیب پیش می‌رود تا اینکه ریبوزوم به انتهای رمز مربوط در روی mRNA برسد.

پایان سنتز زنجیره

پایان سنتز زنجیره پروتئین هنگامی است که ریبوزوم به رمزهای انتهایی روی زنجیره mRNA می‌رسد. در روی mRNA سه رمز پایانی UGA , UAG , UAA وجود دارند، که پایان سنتز زنجیره را اعلام می‌کنند. عواملی که در این مرحله شرکت دارند به نام عوامل آزاد کننده R3 و R2 و R1 معروف هستند. اتصال این عوامل به رمزهای پایانی مربوطه ، باعث می‌شود که آنزیم پپتیدیل سننتاز به جای اینکه پیوند پپتیدی ایجاد کند، مولکول آب را به انتهای زنجیره انتقال دهد. در نتیجه مولکول پروتئین تازه سنتز شده در انتها به عامل COOH پایان می‌یابد و زنجیره آزاد می‌گردد و بلافاصله mRNA و سایر عوامل آزاد شده و دو زیر واحد ریبوزومها نیز از یکدیگر جدا می‌شوند. برای سنتز یک مولکول mRNA چندین ریبوزوم همزمان روی رشته قرار می‌گیرند و در پروتئین سازی شرکت می‌کنند.

منبع : سایت دانشنامه رشد

+ نوشته شده در  شنبه بیست و سوم مهر 1390ساعت 10:20  توسط نادر شهبازی  | 

ژن های پرشی(ترانسپوزون)


ژن های پرشی(ترانسپوزون)

ژن های پرشی توالی از "DNA" هستند که می توانند در جاهای

 مختلفی از ژنوم یک سلول منفرد جا به جا شوند ، که به این

 فرایند جا به جا شدگی می گویند . به وسیله این فرایند سبب

 جهش و یا تغییر مقدار "DNA" در ژنوم میشود . ژن های پرشی

 "ترانسپزون" نیز نامیده می شوند ، و در ضمن نمونه هایی از

 عناصر متحرک ژنی نیز به حساب می آیند.


این موضوع توسط شخصی به نام "باربارا مک کلینتوک" کشف

 شد که این اکتشاف سبب شد تا او جایزه نوبل را در سال

1985 کسب کند او اثبات کرد دلیل رنگارنگی دانه های ذرت

 ترانسپوزون ها اندعلاوه بر گیاهان انها در باکتریها و جانوران وجود

 دارند. عناصر متحرک ژنی متنوع هستند به طوری که می توان

 آنها را بر اساس مکانیسم جا به جا شدگی به دو گروه تیپ 1 و

 تیپ 2 تقسیم بندی کرد.


عناصر متحرک ژنی تیپ 1

رترو ترانسپزون ها چند کپی از خود می گیرند و این رو نوشت ها

 را در نقاط متعددی از ژنوم می چسبانند. این مکانیسم به

 شکلی است که در ابتدا رترو ترانسپزون ها به "RNA" رونویسی

 می شوند و بعد دوباره با آنزیم ترانس کریپتاز معکوس به "DNA"

 بر می گردند و دوباره در ژنوم جای گیری می کنند. رفتار رترو

 ترانسپزون ها خیلی به عمل رترو ویروس هایی همچون " HIV"

 شبیه است، که این سر آغازی برای سیر تکاملی این گونه

 ویروس هاست.


رترو ترانسپزون ها خود به سه گروه اصلی تقسیم می شوند :


Viral Retrotransposons : آنزیم ترانس کرپتاز معکوس را رمز

 گذاری می کنند 


( برای تبدیل "RNA" به "DNA" ) که این دسته تداومی طولانی

"LTR" مانند رترو ویروس ها دارد . 


LINES Retrotransposons : آنزیم ترانس کرپتاز معکوس را رمز

 گذاری می کنند اما بر خلاف نوع اول تداوم کوتاهی دارد، و

 توسط "RNA" پلیمراز "II" رونوسی می شوند.


Nonviral superfamily Retrotransposons : آنزیم ترانس کرپتاز

 معکوس را رمز گذاری نمی کنند و توسط "RNA" پلیمراز "III"

 رونویسی می شود.


عناصر متحرک ژنی تیپ 2

بزرگترین تفاوت این دسته از ژن های پرشی با رترو ترانسپزون

 ها در این است که مکانیسم جا به جا شدگی در این دسته ب

ر خلاف نوع " I" مستقیم صورت می گیرد و نیازی به رو نویسی

 های متعدد و تبدیل شدن به "RNA" نیست.عناصر متحرک ژنی

 تیپ 2 توسط آنزیم ترانسپزاز برای "بریدن و چسباندن" به طور

 مستقیم از نقطه ای به نقطه ی دیگر ژنوم جا به جا میشود.ژن

 های پرشی برای پژوهشگران بسیار مفید است ، 


بر پایه اعلام پژوهشگران، ترانسپوزون ها در تمام ژنوم پراکنده

 هستند و به ویژه بر بزرگی و موقعیت "سنترومر" ها تاثیر می

 گذارند


* به دلیل اینکه نوترکیبی ترانسپوزون عمدتا در سلولها

 سوماتیکی رخ میدهد و به ارث نمی رسند در پس در وراثت

 افقی نقش دارند 


* بنابراین آنها باعث افزایش ،حذف ،تغییر کمیت و کیفیت

 رونویسی،الگو بیان ژن و تنوع اللها میگردند.

+ نوشته شده در  شنبه بیست و سوم مهر 1390ساعت 10:19  توسط نادر شهبازی  | 

انواع PCR

 

انواع PCR

 

RT-PCR:

الگوي اوليه دراين روش مولكول RNA تك زنجيره اي است.ازآنجائيكه DNA پليمراز قادربه استفاده ازRNAبعنوان الگو نميباشد،مرحله ديگري به PCR اضافه شده است.طي اين مرحله با استفاده از آنزيم RT(Reverse Transcriptase) از الگويRNA  ،مكملش يعني cDNA سنتز ميشودوسپس بوسيله تكنيك PCRتكثير مي يابدآنزيم نسخه بردار معكوس دراين روش ازويروس ميلوبلاستوماي مرغ (AMV) بدست مي آيد.كاربرد اين آنزيم به دليل حساس بودنش به حرارت پايين بوده ولي با كشف باكتري به نام ترموس ترموفيلوس اين روش بهبود يافت.اين باكتري DNA پليمراز مقاوم به حرارت به نام Tthتوليد مي كندو در حضور يون  منگنز داراي فعاليت نسخه برداري معكوس است و در دماي°C72 توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود.سپس منگنز اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسيد EGTA حذف ميشودواين آنزيم ازDNA اي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي كند.براي تكثير ماده ژنتيكي ويروس هاي RNAدار مثل HIV از اين روش استفاده ميشود.

 PCRنامتقارن( Asymmetric PCR):

هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است.در اين روش يكي از پرايمرها  به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر به محيط واكنش اضافه  مي شودتا جائيكه اين نسبت 1:50 يا  1:100 برسد.در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردداما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد

 ARMS PCR 

 (Amplification Refractory Mutation System): 

اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده است دو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي جهش يافته و ديگري حاوي پرايمر طبيعي مي باشد در هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصي الل مورد استفاده قرارميگيرد.حالت اختصاصي پرايمرهابراي هريك ازاللها ناشي از نوكلئوتيد انتهاي 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده.چنانچه پليمريزاسيون  در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه اي در باز مورد نظراست واگر پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه اي در باز مورد نظر است.نكته مهم اين است كه از DNAپليمرازي كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگي اگزونوكلئازي  َ5َ  à   3َ است،استفاده شودزيرا استفاده از يك آنزيم اصلاحگر باعث برداشتن باز جفت نشده انتهاي 3َ ميگردد و در واقع توانايي متمايز كردن دو الل از بين ميرود. از اين روش در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري ها استفاده مي شود.

 

Hot-Start PCR:

 زمانيكه بهترين شرايط اتصال فراهم شود باندهاي غير اختصاصي ممكن است قبل از انجام اولين چرخه PCR ايجاد شودحتي تاوقتيكه دماي لوله ها تا°C70-°C65 افزايش مي يابد اتصالات غير اختصاصي پرايمر/پرايمر و پرايمر/ الگوممكن است بوجود آيد و بعنوان سوبستراي اوليه براي DNAپليمراز عمل كند.ساده ترين روش براي جلوگيري ازچنين اتصالات اوليه غيراختصاصي وبهتركردن شرايط اتصال صحيح پرايمر،استفاده از روش Hot start است كه اساس اين روش بر جدا كردن فيزيكي مواد واكنش تا زمان رسيدن به دماي بالا مي باشد.يك يا چندماده قبل از رسيدن به دماي بالاتر از °C70 از واكنش جدا مي شود و پس از رسيدن به دماي بالا در واكنش وارد مي كنند.ارزان ترين روش اضافه كردن تمامي مواد واكنش به جز    DNA پليمراز است.اين روش براي تعداد زياد نمونه ها به دلايل زيرامكان پذير نيست:1-زمان مورد نياز براي اضافه كردن آنزيم به هرلوله زياد است.2-اشتباه هاي ناشي از عدم تمركز حواس كه باعث اضافه نكردن آنزيم به يك يا چند لوله ميشود .3 -احتمال آلودگي لوله ها به دليل باز شدن در آنها. براي حل اين مشكل وتسهيل انجام PCRگرم آغاز يك سري محصولات تجاري عرضه شده است.مثل Ampliwax Gemsكه گلوله هاي مومي با فرمول خاص ميباشند. يك عدداز آن را در لوله هاي حاوي پرايمر،dNTPs(دئوكسي نوكلئوتيد تري فسفات)،Mg++ اضافه كرده و واكنش در يك ترموسايكلر در دماي  °C80-°C75 به مدت 10-5 دقيقه نگهداري ميشود تا موم ذوب شود سپس لوله ها تا زير°C35 سرد ميشودتا موم مجددا جامد شودو يك لايه محافظ بر روي مواداوليه واكنش تشكيل شود.موادديگر واكنش از قبيل DNAالگو،DNAپليمراز و بافر را ميتوان بر روي لايه موم ريخت و سپس PCR را آغاز كرد.در هنگام بالا رفتن دما موم ذوب ميشود و مواد جامد موجود در لايه رويي موم با مواد پايين مخلوط ميشوند تا PCRآغاز شود و موم به روي فاز آبي قرار ميگيردلايه موم هم يك سددر برابرتبخيرآب درحين چرخه هاي دمايي است وهم بصورت يك مانع فيزيكي،براي جلوگيري از آلودگي عمل ميكند

 Randomly amplification polymorfic DNA)RAPD-PCR):

 اين روش تحت عنوان PCR با پرايمرهاي متزلزلArbitrarily primed PCR  نيز ناميده مي شود.يك روش سريع برای انگشت نگاري ژنومي مي باشدو انگشت نگاري ژنومي در تحقيقات جنايي،جرم شناسي،پزشكي قانوني ذرتعيين والدين وروابط پدر فرزندي وتعيين روابط خويشاوندي نقش تعيين كننده دارد.دراين روش تنها از يك پرايمر چند نوكلئوئيدی كوتاه(10-9نوكلئوئيدي محتوي 50%GC )كه بطور تصادفي از توالي هاي بازي انتخاب شده است برای ساخت DNA از روي ناحيه اي از DNAالگو كه پرايمر تا حدي متصل مي شود،استفاده ميشود.RAPD-PCR براسا س تكثير تصادفي در دماي پايين انجام مي شود،نواحي مختلف ژنومي به طوهمزمان در يك واكنش PCR قابل تكثير مي باشد. چرخه هاي ابتدايی بايد دردمای پايين°C50- °C37 معمولا براي 5چرخه اوليه انجام شود تا پرايمر به جايگاه هاي تصادفي در داخل ژنوم متصل شوند.پسس دما افزايش مي يابد (°C55)،واكنش براي 35-30 چرخه ديگر ادامه مي يابد،در واقع تنها جايگاه هاي مناسب تر از بين جايگاه هاي  تصادفي اوليه تكثيرخواهند شد.البته اگر مكان هاي اتصال پرايمر روي دو رشته الگو در فاصله مناسبي قرار گرفته باشند، و جهت گيري مناسبي نيز نسبت به هم داشته باشند،DNA پليمراز قادر به طي كردن فاصله بين 2 پرايمر اتصال يافته خواهد بود.با بهينه سازي دقيق مي توان در حدود 50 تا 100 قطعه DNA مختلف بدست آورد.اين چند شكلي هاي DNAيا از اختلافات موجود در توالي DNAدر مكانهاي اتصال پرايمر يا از دگرگوني هايي كه در اثر اضافه شدن،حذف و واژگوني در نواحي تكثير شده روي داده است،منشاء ميگيرد.باندهاي مشاهده شده بازتابي ازساختمان كل مولكول DNAاستفاده شده به عنوان الگو مي باشند.اين روش تكنيكي عالي درفيلوژنتيك ياشجره شناسي ميباشد، انتظارميرودكه دو موجود زنده خويشاوند داراي الگوي باندي مشابه تري نسبت به2 موجودي باشندكه از نظرتكاملي دورتر هستند

 PCRداخلي يا لانه اي  ( Nested PCR) :

راه حلي براي افزايش حساسيت ودقتPCR است وجداسازي محصول اختصاصي  مورد نظر را از بين انبوه محصولات غير اختصاصي ميسر مي سازد .دراين روش ازدوجفت پرايمراستفاده مي شودطوريكه جفت دوم دربين جفت اول جاي مي گيردابتدا پرايمراول(پرايمربيروني) اضافه مي شود و باعث تكثير قطعاتي از DNA مي شودكه احتمالا تعدادي از آنها محصولات غيراختصاصي اند. محصول PCR واكنش اول به عنوان DNA الگو براي PCR دوم در حضور پرايمرهاي داخلي(پرايمردوم) كه مكمل قسمت داخلي تر قطعه DNAموردنظر است مورد استفاده قرار ميگيرد.احتمال بسيارضعيفي وجوددارد كه محصولات غيراختصاصي براي جفت پرايمرداخلي اختصاصي ديگرنيزداراي محل شناسايي باشند نتيجاَ اين امرباعث افزايش نسبت محصول واقعي به محصول غيراختصاصي خواهدشداگر طراحي 2پرايمر داخلي به دليل عدم دسترسي به توالي كامل ممكن نباشد مي توان با استفاده از توالي پرايمر اوليه با افزودن 2 يا 3 نوكلئوتيد به انتهاي 3َ پرايمردوم راطراحي كرد بااينكه پرايمرهاي داخلي همپوشاني قابل توجهي باپرايمرهاي اوليه دارداما باعث تكثيراختصاصي توالي هدف وحذف محصولات غيراختصاصي ميشود.البته در اين حالت نبايد از آنزيمهاي داراي فعاليت تصحيح خطا 3َاگزونوكلئازي استفاده كرد تا انتهاي 3َتعين كننده حفظ شود.

 PCR معکوس(Inverse PCR):

دراين روش هدف تكثير قطعه اي ازDNAاست كه هيچ اطلاعي در مورد توالي پايانه هاي آن در دست نيست ولي در عوض توالي قسمتي از يك ناحيه دروني آن در دست است.براي اين هدف DNAژنومي با يك آنزيم محدودالاثرمناسب هضم ميشودوسپس اتصال مجدد 

مولكولها جهت بدست آوردن قطعات DNAحلقوي.بعد از حلقوي شدن توالي هدف شناخته شده با يك آنزيم محدودالاثرديگرهضم ميشودكه اين امر باعث قرارگيري نواحي ناشناخته بين 2ناحيه شناخته شده حاصل از هضم آنزيمي ميشود.حال باطراحي پرايمرمناسب براي توالي شناخته شده ميتوان نواحي ناشناخته راتكثيركرد.اين روش براي شناسايي جايگاه هاي الحاق ويروسها و ترانسپوزونهايي كه بطور تصادفي در ژنوم ادغام ميشود مفيد است

 PCRچندتایی(Multiplex PCR  ):

دراين تكنيك ازچندين جفت پرايمراختصاصي دريك محلول PCR جهت تكثير چندين توالي هدف در يك زمان استفاده مي شودبنابرين مي توان با آزمايشات كمترو زمان كوتاه تراطلاعات بيشتري جمع آوري كرد.انواع :Multiplex PCR1- واكنش PCR با يك الگو:كه دراين روش يكDNA الگودر طولش با چندين جفت پرايمر جهت تكثير نواحي مخصوص جفت ميشود.با توجه به اينكه محصولات بدست آمده اندازه متفاوت دارندبخشهاي بزرگي از يك DNA هدف جهت جستجوي تغييرات مي توان بررسي شود.2-واكنش PCR با چند الگو: در ميكروب شناسي باليني با استفاده ازاين روش در عفونتهاي مخلوط امكان شناسايي چندين عامل بيماري در يك نمونه بطورهمزمان وجوددارد.باپرايمرهاي مختلف و ويژه به جستجوي عوامل مختلف پرداخته ميشود پي به منشاء عفونت ميبرند.چونكه دراين تكنيكهاازچندين پرايمراستفاده ميشود رعايت نكات زيرضروري است:1- بايدپرايمرهارا به گونه اي طراحي كردكهTmدماي ذوب يكساني داشته باشندو يااختلاف دماي ذوب پرايمرها بيش از °C5-°C3نباشد.2- اختصاصيت پرايمرهاي طراحي شده براي توالي هدف مهم است3-پرايمرهاي طراحي شده بايد براي تشكيل دايمرپرايم با همه پرايمرهاي حاضر در مخلوط واكنش بررسي شود.چون ديمر شدن منجر به تكثير محصولات غير اختصاصي ميشود.

Real time PCR:

در اين سيستم تشخيصي يك ماده فلورسانت در طي واكنش متناسب با ميزان محصولات هرسيكل آزادميشودوميزان فلورسانت آن توسط دتكتورشناسايي وثبت ميگرددوبدين ترتيب ميزان DNAتكثير شده طي يك چرخه تا چرخه بعدي را ميتوان اندازه گيري كرد.بنابراين ميزان محصول در هرچرخه قابل رديابي است در حاليكه محصول روشهاي سنتي پس از پايان واكنش و الكتروفورز مشخص ميشود.

روشهاي سنجش با Real time PCR:1- استفاده از رنگهاي فلورسنت مثل سايبرگرين:همزمان با دورشته اي شدن DNAسايبرگرين به شياركوچك DNAمتصل ميشودوبا جذب طول موج498نانومتري، نور522 نانومتري را ساطع ميكند.با افزايش مقدار محصول PCRرنگ بيشتري متصل ميشودو ميزان فلورسانس افزايش مي يابد ،پس ميزان فلورسانس متناسب با مقدار DNA دورشته اي در واكنش است اما مهمترين عيب آن اتصال به دو رشته هايي مثل پرايمردايمر و ديگر باندهاي غيراختصاصي است كه باعث مي شود نتايج بيشتر از غلظت اصلي برآورد شود. 2- استفاده از پروبهاي فلورسنت:پروبها برخلاف سايبرگرين براساس تشخيص اختصاصي توالي محصول كار ميكنند.پروبها معمولا يك رنگ فلورسنس زا درانتهاي َ5(Reporter)  و يك رنگ خاموش كننده درانتهاي 3َ ( (Quencherدارندو وقتي در فاصله مولكولي نزديكي قرار دارند بازتابشي در دستگاه ثبت نميشود اما پس از جدايي نور ساطع شده از Reporter توسط Quencher قابل جذب نيست و توسط دستگاه بصوذت فلورسانس قابل اندازه گيري است.مثلا استفاده ازپروب Taq Man كه اساس آن اگزونوكلئازي DNA پليمراز Taqاست.يك پروب 30-20 نوكلئوتيدي كه در انتهاي 5َ به يك رنگ فلورسانس متصل است و در انتهاي 3َ به يك عامل خاموش كننده. پروب حدود چندباز بعداز انتهاي 3َيكي ازپرايمرها طراحي ميشودآنزيم پس از نزديك شدن به پروب با استفاده از  فعاليت  َ3 à  5َاگزونوكلئازي خود پروب را ليز ميكند و در نتيجه رنگ فلورسانس از عامل خاموش كننده جدا ميشود و باعث ايجاد فلورسانس ميگردد.

RACE-PCR  :

 در این روش ابتدا یک پرایمر حاوی دم یا قلاب داریم که به تک رشته ای mRNA اضافه می کنیم سپس آنزیم نسخه بردار معکوس را نیز اضافه می نماییم در نتیجه cDNA hybrid ساخته میشود سپس با استفاده از یک جفت پرایمر عمل PCR انجام می شود. بدین ترتیب در دو رشته حاصل یا محصول نهایی PCR  قلابها وجود دارند.

 

 LIGATION-PCR :

در اینجا رشته الگو یمان تک رشته ای است که بخشی از ترادف آن مشخص ولی بیشتر ترادفش نامشخص است برای انجام این روش ابتدا بوسیله یک پرایمر اختصاصی به نام Extension PRIMER رشته مکمل ساخته و مصصول با یک لینکر دو رشته ای لایگیت می شود سپس به وسیله 2 پرایمر که مخصوص لینکر و دیگری مخصوص ترادف است عمل PCR انجام میگردد.

 

+ نوشته شده در  شنبه بیست و سوم مهر 1390ساعت 10:15  توسط نادر شهبازی  | 

PCR چيست ؟

PCR چيست ؟

عنوان مقاله: (PCR)Polymerase Chain Reaction واکنش زنجیره ای پلیمراز


PCRبه علت دارا بودن ویژگی وحساسیت بالا وسرعت وسهولت آن جایگاه ویژه ای درتحقیقات وتشخیصهای مولکولی پیدا کرده است.PCR درسال1983توسط دکترMullis ابداع شد،که جایزه نوبل شیمی رادرسال1993 دریافت کرد.

PCR در محیط آزمایشگاه(in vitro) امکان تکثیریک توالی معین ازDNAراکه بین دوتوالی مشخص قراردارد امکان پذیرمی کند تا DNA ازنظرمقدار به حدکافی برسد وبتوان روی آن آزمایشهایی مثل الکتروفورز-ژل آگارز- پلی اکریل آمید،هیبریداسیون باپروب راانجام داد.این روش ازنظرعلمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد.دکترMullis اولین بار ازآنزیمDNA پلیمراز اشریشیا کولی برای انجام PCR استفاده کرد.



کاربردPCR

تعین جنسیت جنین،تعیین ژنوتیپ اپیتوپهای پیوندی ،تعیین ژنوتیپ گروههای خونیABO ،تهیه نسخه های متعدداز یک ژن،تشخیص بیماریها واختلالات ژنتیکی ،تشخیص بیماریهای عفونی ،ردابوت وتعیین والدین مطالعات باستان شناسی ،تعیین انواع لوسمیها ،تولیدوطراحی واکسنهای انسانی ودامی ،پزشکی قانونی وانگشت نگاری،DNA ازروی لکه خشک شده خون ،درتشخیص HIV ،سل وبیماریهای مقاربتی.

درحقییقت این تکنیک می رود تا دراینده نتیجه گیری دادگاهها راتحت تأثیرقراردهد.

دانشمندان اکنون می توانند میکروارگانیسمهای غیرقابل کشتی راکه تا کنون نمی توانستند با روشهای کلاسیک میکروب شناسی مورد مطالعه قراردهند به کمک PCR مطالعه نمایند .



نمونه های مورداستفاده برای آزمایشگاه مولکولیPCR

طیف وسیعی ازمواد بیولوژیک ،لکه های خون،سرم،بزاق،منی ،مو ،مایع نخاعی ،استخوان، مایع آمنیون،سلولهای خودجنین درمرحله بلاستولا ،نمونه های بیوپسی ویا آتوپسی باشند هرچه آلودگی کمترباشد حساسیت ودقت نتایج بیشتر خواهد بود.



اصول وروشهای PCR

روش PCRبرمبنای سه روش ساده بنا شده که انجام این سه مرحله درهرواکنش سنتز DNA ضرورت داردکه با برنامه دادن به Thermocycler اجرا می شود وعبارتند از:

1- مرحله Denaturation: دراین مرحله DNA هدف براثرحرارت تک رشته ای می شود،حرارت90-95 درجه سانتیگراد

2- مرحله Annealing : دراین مرحله با کاهش حرارت سیستم ،پرایمرها درمحل مناسب روی رشته مکمل متصل می شوند ،دما53-75 درجه سانتیگراد، درمرحله Anneling بایددقت لازم بعمل آیدودما باید به درستی انتخاب شود این کار توسط کامپیوتر به طور مستقیم ویا توسط محقق وبا توجه به دانش فنی وتجربه صورت می گیرد اگردمای Annealing بدرستی انتخاب نشود احتمال تکثیر غیراختصاصی DNAوجوددارد به طوری که دردمای پایینتراز حداستانداردAmplication غیراختصاصی ودر دمای بالاتر ازمعمول عدم تکثیرDNA دخ می دهد.

3 – مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای انزیم DNA پلیمراز مطلوب می باشد موجب توسعه پرایمرها شده وهمانندسازی DNA هدف انجام می گیرد.دما حدود72 درجه سانتیگراد آنزیم مقاوم به حرارت Taq polymerase چهارتا نوکلئوتید dATP ، dGTP ،dTTP، dCTP موجود درمحیط وبافرهای PCR شامل Tris وپرایمرهای جفت شده به DNA را درحضورMgcl2 مورداستفاده قرار می دهد و واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می نماید وسبب طویل شدن رشته DNA جدیدی که توسط پرایمر ساخته شده است می شود .



نتیجه چرخه سه مرحله ای فوق سنتز دو مولکول جدیدDNA است ،سنتز DNA جدید به صورت تصاعدی آنقدر ادامه می یابد تا اینکه یکی ازمواد تشکیل دهنده محیط واکنش کاهش یابد وغیرفعال شود. به طورکلی حدود35-25 سیکل کافی است تا ازمقدار بسیارکم DNA صدها هزارنسخه DNA سنتز گردد. ازنظرتئوری بعداز20 سیکل 1میلیون وبعداز 30سیکل 1میلیارد کپی حاصل می گردد.نکته ای که درمراحل مختلف PCR بایدمورد توجه قرارگیرد زمان لازم برای رسیدن ازیک دما به یک دمای دیگرکه زمان کوتاهی است (Ramping Time).





پارامترهای مؤثر در PCR :



1- زمان ودمای Denaturation بستگی به تعداد C و G دارد

2- دمای Annealing پرایمرها که باید4-3درجه کمترازدمای ذوب پرایمرها باشد

3- زمان Primer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

4- تعداد سیکلها

5- Ramp (زمانی که طول می کشد تا دمای مبدادستگاه به دمای مقصد برسد)هرچه این زمان کمترباشد نتیجه کاربهتراست و واکنش زمان کمتری دردمای ناخواسته قرار می گیرد

6- غلظت dNTP ها ویون منیزیوم(اینها مجموعه ای راتشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز می شوند وغلظت این دوماده تابعی ازیکدیگر می باشند)

7- غلظت Template DNA (یک دهم تایک میکروگرم می باشد)چنانچه DNA هدف به صورت مالتی کپی درژنوم باشد بهتراست

8- اضافه کردن تشدیدکننده های PCR

9- حذف مهارکننده های آنزیم ازمحیط

10- بهتراست نقطه ذوب پرایمرها شبیه هم باشد(Tm یکسان داشته باشند)





طراحی پرایمر:

پرایمرهای PCR به صورت کاملاً اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظرDNA هدف طراحی میگردند.پرایمرها 30-20باز دارندوپرایمرهای بیش از30بازاختصاصیت خوبی ندارند.همچنین پرایمرها بایددمای انیلینگ بالا داشته باشند.بهتراست تعدادبازهای دو پرایمر مساوی باشند واز پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند،همچنین نواحی تکرارشونده نداشته باشندچنانچه بازهای GیاC به صورت تکراری وپشت سرهم باشند پرایمربه صورت لوپ در می آید وعملاًسیستم کارنمی کند.نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند.بعداز طراحی پرایمربهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast انها را چک نمود تامشخص شود که با چه ژنهای دیگر می توانند Anneal گردند.

استخراجDNA ازخون:



1- مقدار100 میکرولیتر خون (خون لخته نشده باشد - برای کارهای PCR ازEDTA بعنوان ضدانعقاد استفاده شود زیرا مواد ضدانعقاد دیگر مهارکننده آنزیم پلیمراز میباشند)

2- مقدار 700 میکرولیترDNG ( ماده ای برای استخراج DNA که به مدت 20 دقیقه در دمای 37درجه که این ماده معرف اصلی کیت می باشد )اضافه می کنیم

3- به مدت 15ثانیه آن را ورتکس می کنیم

4- به مدت 5دقیقه در دور 3000 سانتریفیوژ می کنیم

5- سپس خون را از میکروتیوب به میکروتیوب دیگر انتقال می دهیم بدون اینکه لخته ها وارد شود

6- به داخل خون 500 میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم سپس تکان می دهیم تا هاله سفیدرنگی تشکیل شود

7- درفریز 20- درجه به مدت 20 دقیقه قرار می دهیم

8- بعد از فریز به مدت10 دقیقه در دور13000 سانتریفیوژ می کنیم

9- محلول رویی را دور ریخته وبه لکه پایین cc1 اتانل 75درصد اضافه می کنیم

10- مقدار5-2 میکرولیتر آن را برای واکنش PCR استفاده می کنیم





استخراج DNA ازبافت:



1 - مقدار100 میلی گرم بافت توسط ازت مایع پودر می کنیم (به بافت ازت مایع اضافه می کنیم و

بوسیله هاون به هم می زنیم) واز این 100 میکرولیتر بر می داریم وداخل میکروتیوب می ریزیم

2 - 400 میکرولیتر DNG به بافت اضافه می کنیم

3- به مدت 15 ثانیه ورتکس می کنیم

4- 300 میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم

5- یک لایه شیری رنگ تشکیل می شود که DNA است به مدت 20 دقیقه داخل فریزر 20- قرار می دهیم



بایدها ونبایدها در PCR :

1- آزمایش باید در محلی بدون رفت و آمد انجام گیرد

2- سمپلرهای مورد استفاده نباید برای کارهای دیگر استفاده شوند ،ظروف لوله ها وسرسمپلرها اتوکلاو شوند وهنگام کار از دستکش استفاده شود( برای ممانعت ازعمل آنزیم DNase که سبب تخریب DNA هنگام استخراج DNA می شود وممانعت از عمل آنزیم RNase که سبب تخریب RNAهنگام استخراج RNA می شود) چون این دو آنزیم در محیط کار ودستها زیاد است

3- هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کارتهیه کنید

4- اعمال قبل وبعد PCR جدا از همدیگر انجام گیرد

5- برای استفاده از هرماده از پیپت جداگانه واختصاصی استفاده کنید

6- هنگام استفاده هرلوله را spin کنید تاموادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند جدا شده ورسوب کنند

7- چندین کنترل منفی حین آزمایش Runکنید

8- برای انجام آزمایشهای تاییدی از مواد فریز شده استفاده کنید

9- همیشه DNA آمپلی فای شده راخارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید

10- هنگام کار باPCR product مقداری از آن را جداگانه نگهدارید



موادی که برای PCR لازم است :



1- بافرPCR - x10 (PCRدرحجم 25یا50 میکرولیترانجام می گیرد برای حجم 25 میکرولیتر 2.5میکرولیتربافرنیاز است

2- DNTP(نوکلئوتیدها)0.5میکرولیتر

3- Mgcl2 1 میکرولیتر

4- پرایمررفت 1 میکرولیتر

5- پرایمر برگشت 1 میکرولیتر

6- DNA 1 میکرولیتر

7- آنزیم 0.2 میکرولیتر

8- آب مقطر 17.8 میکرولیتر(مجموع مواد بالا منهای 25 می شود 17.8 که آب است)

بعد از ریختن مواد بالا در لوله های مخصوص PCR لوله ها را داخل Block دستگاه ترموسایکلر قرار دهید ودستگاه را روشن کنید (مقدار 100 میکرولیتر روغن معدنی روی واکنش بریزید تا از بخار شدن مواد ممانعت بعمل آورد.لازم به ذکر است که دستگاههای ترموسایکلرجدید به صورت Heated lid ساخته شده اند یعنی درب دستگاه که روی لوله های واکنش قرار میگیرد حدود 105 درجه گرم میشود در نتیجه بالای لوله گرمتر از پایین آن است واز بخار شدن مواد داخل لوله جلوگیری می شود ) پس از اتمام کار محصول آمپلی فای شده را با اگارز 3درصد الکتروفورز کنید.





منابع ومأخذ:

مبانی مهندسی ژنتیک نوشته M.T.Davson (GENE Technology )
WWW.protocol-online.org
ماهنامه TASHKhIS AZmayeshgahi (laboratory diagnosis)
William.ceccarelli,A.andspurr,N.(1993) Genetic engineering.

+ نوشته شده در  شنبه بیست و سوم مهر 1390ساعت 10:12  توسط نادر شهبازی  | 

PCR چیست ؟

 

PCR چیست ؟

حقیقت علمی اساسی که موجب می شود PCR این چنین مفید باشد به این صورت است : ماده ژنتیکی هر موجود زنده نظیر گیاهان یا حیوانات – باکتری ها یا ویروسها – دارای زنجیره ای از ساختار نوکلئو تیدی (معمولا DNA  و گاهی RNA ) هستند که به صورت بی نظیر و منحصر به فردی تنها در گونه های مخصوص خو دشان یافت می شوند . بنابراین ، موجودات زنده پیچیده نظیر انسان ، دارای زنجیره هایی از DNA هستند که به صورت بی نظیر و منحصر به فردی در افراد خاص مشاهده می شود. این گوناگونی های بی نظیر این امکان را فراهم می آورند تا ماده ژنتیکی را بامراجعه به موجود زنده پیگیری کردو حداقل به دقت ، گونه موجود زنده را که ماده ژنتیکی از آن گرفته شده شناسایی کنیم  و اینکه بدانیم از کدامین عضو مخصوص آن موجود زنده گرفته شده است. چنین بررسی نیازمند این است که مقدار کافی DNA برای تحقیق و تجزیه موجود باشد در این موقع PCR  مطرح میشود . PCR  عملکرد طبیعی آنزیم ها را بطور چشمگیری افزایش میدهد که این عمل پولیمراس نامیده میشود. این آنزیمها در تمامی موجودات زنده وجود دارند و کارشان کپی کردن  مواد ژنتیکی و (همچنین تصحیح و درست کردن این کپی ها ) می باشد. PCR  گاهی با نام فتوکپی مولکولی نامیده میشود و می تواند هر گونه خاص از DNA یا RNA رامشخص ، تجزیه و سنتز کند. PCR گاهی بر روی مخلوطهای بسیار پیچیده نیز کار میکند تا به جستجو، شناسایی و دوبرابر کردن قسمت کوچکی از ماده ژنتیکی خون، مو یا نمونه بافتی ، از میکروبها ، حیوانات ، یا گیاهان که حتی گاهی بیشتر آنها هزاران یا میلیونها سال قدمت دارند ، بپردازند.  

مراحل PCR چنان آسان هستند که حداقل برای زیست شناسان مولکولی که کری مولیس مخترع آن است این سوال پیش می آید که چرا من در این مورد فکر نکرده بودم؟ در میان جوایزعلمی بیشماری که مولیس برای تفکر بسیار شگفت انگیز خود که در حین رانندگی زیر نور مهتاب در سال 1983 به ذهنش خطور کرده بود،دوتای آنها خیلی مشهور بودند. یکی جایزه ژاپن و دیگری جایزه نوبل که هر دو در سال 1993 به او اعطا شده بودند .  

PCRنیازمند یک مولکول نمونه است – یعنی DNA یاRNAای که می خواهید از آن کپی بگیرید و همچنین دو مولکول اولیه که بتوان مراحل کپی کردن را باآنها شروع کرد. مولکولهای اولیه زنجیره های کوتاه چهار ترکیب شیمیایی مختلف هستند که شاخه های مختلف مواد ژنتیکی را تشکیل میدهند. این چهار نوع ترکیب نظیرآجر یا

DNA به خودی خود نوکلئوتید نامیده میشود. تحت بسیاری از شرایط DNA دو شاخه میشود و شامل دو زنجیره نوکلئوتیدی است که بدور هم می پیچند و شکل مشهور مارپیچ دوگانه را بخود می گیرند. مولکولهای اولیه تک شاخه هستند . آنها شامل یک رشته از هسته ها هستند که با نظم خاصی قرار گرفته اند و تحت شرایط مناسب به شکل زنجیره ای از هسته های مکمل خاصی به هم می چسبند و به شکل تکه ای از DNAیا RNAتک شاخه  در می آیند.

برای PCR،مولکولهای اولیه باید یک کپی از زنجیره های نوکلئو تیدی در هر دو طرف قطعه DNAدر اندازه در نظر گرفته شده باید باشند این بدان معنی است که ترتیب دقیق نوکلئو تیدهای اولیه قبلا باید شناخته شده باشند. این زنجیره های یک پهلو را می توان در آزمایشگاه ایجاد کرد یا آنها را از منابع تجاری خریداری کرد.

سه مرحله اصلی در PCRوجود دارد. ابتدا ، ماده ژنتیکی هدف باید از حالت طبیعی خارج شود، این بدان معنی است که شاخه های مارپیچش از هم باز و جدا شوند این کار توسط گرما دادن در دمای 90تا 95 درجه سانتیگراد صورت میگیرد. مرحله بعدی هیبرید کردن یا سرد کردن آهسته است که مولکولها را به صورت مکملهای بنیادی  DNA- تک شاخه در آوریم. مرحله سوم ترکیب کردن DNAتوسط روش پلیمراس می باشد. اگر از مولکولهای اولیه شروع کنیم ، پلیمراس می تواند شاخه نمونه را تشخیص داده و به سرعت آن را با نوکلئوتیدهای مکمل  تطبیق دهد. نتیجه دو شاخه مارپیچی جدید به جای تک شاخه اولیه بود. هر شاخه شامل یکی از شاخه های اولیه به علاوه شاخه مکمل است که با آن جفت شده است .

تمام چیزهایی که PCRبرای تجهیز شدن نیاز دارد، لوله واکنش ، معرف شیمیایی ، و منبع گرماست . ولی هر کدام از این سه مرحله دمای مطلوب خود را می خواهد . به همین دلیل در حال حاضر کنترل دماهای مختلف توسط ماشین وبه صورت اتو ماتیک ( خودکار) صورت می گیرد.

اگرDNA – ی بیشتری می خواهید، فقط مراحل مختلف را تکرار کنید و با از حالت طبیعی درآوردن DNA- ای که قبلا ایجاد کرده اید این کار را انجام دهید. هر بار که این کار را انجام دهید مقدار DNAدو برابر می شود . با گردش گرمای سریع و سرد کردن کنترل شده به صورت خودکار طبیعت به کمک دانشمندان ، مولکولهای اولیه ، پولیمراس ، نوکلئوتیدها و معرف شیمیایی را فراهم میکند هر دوره گردش 1 تا 3 دقیقه طول می کشد بنابراین با تکرار کردن مراحل تنها به مدت 45 دقیقه میلیونها کپی از رشته های مخصوص DNAرا تولید می کند. زمانی که مولکولهای اولیه مشخص شده و به دست می آیند، PCRمی تواند کاری را که در عرض یک سال انجام می شد در عرض یک هفته انجام دهد البته ممکن است بعضی مشکلات فنی در رابطه با PCRبوجود آید. مهمترین این مشکلات فاسد شدن نمونه با ماده ژنتیکی خارجی است که می تواند کپی های متعددی از DNAهای نا متناسب تولید کند. نتیجه اغلب غیر قابل استفاده است ولی گاهی منجر به نتایج نادرست میشود. آزمایشگاهها اغلب در مورد معرفی تصادفی حتی تعداد معدودی از مولکولهای آلوده ، بخصوص DNAهای توسعه یافته از مشاهدات و آزمایش های قبلی بسیار محتاطانه عمل می کنند. جلوگیری از آلودگی وفساد مهمترین مشکل در کاربردهای انسانی است. نظیر استفاده از دارو یا قانون ، که زندگی افراد واقعا در گرو تعادل و موازنه است .

-PCRای که به صورت سریع خودکار شده است برای افزایش خارق العاده در استفاده از آن در علوم حیاتی بسیار کلیدی است و راه حل کلیدی برای به حرکت درآوردن مراحل مختلف پلیمراس {تک} است. تک یک اسم مستعار برای ترموس آکاتیکوس است . که یک نوع باکتری است که خوشبختانه در محیطهایی که برای موجودات زنده دیگر مرگبار است به حیات خود ادامه می دهد و تولید مثل می کند نظیر چشمه های داغ . به همین دلیل است که پلیمراس موجود زنده در نوسانات سریع دمای PCRفعال شده بدون تغییر باقی می ماند . برخلاف سایر پلیمراسها ، آنزیمی که از{تک} استخراج میشود و اکنون در مقادیر تجاری توسط باکتریهاییکه به روشهای ژنتیکی تولید می شوند به دست می آیند در مقادیر بالای دما ثابت می ماند . میکروبیولوژیستها (زیست شناسان مولکولی) که این اجزای زنده را دهها سال پیش کشف کردند ، و چندین سال صرف فیزیولوژی و بیوشیمی آنها کردند، هیچ راهی برای درک اینکه این باکتریها تا چه حد برای سلامت انسانها حیاتی هستند نداشتند و اینکه تا چه حد در اقتصاد تاثیرگذار هستند معلوم نبود .

PCRچگونه مورد استفاده قرار می گیرد ؟

سلامتی انسان و پروژه ژنوم انسانی

به زودی PCRتبدیل به وسیله ای ضروری برای بهبود سلامتی انسان ها و حیات آنها شد . تحقیقات پزشکی و داروهای کلینیکی به طور عمده از PCRدر دو ناحیه سود می برند  : جستجوی اجزای بیمار عفونی و جستجوی تحول و دگرگونی در ژنها ، بخصوص ژنهای انسانی زیرا که PCRمی تواند مقادیر بسیار ریز غیر قابل تصوری

از DNAرا گسترش دهد ، و حتی این کار را توسط یک سلول انجام می دهد ، پزشکان و محققین می توانند یک اسپرم تنها را مورد آ زمایش قرار دهند یا منابع گمراه کننده یک عفونت مرموز راپیگیری کنند . این بررسیها که مبتنی بر PCRهستند همانند سایر روشها قابل اطمینان شناخته شده اند و حتی در بیشتر موارد سریعتر و ارزانتر از این روشها هستند .

این روش بخصوص برای جستجوی عوامل بیماری که کشت آنها مشکل یا غیرممکن است ، مفید می باشد . این عوامل ممکن است انواع مختلف باکتری ، قارچ ، و ویروس می باشند چرا که این روش می تواند مقادیر تجزیه پذیری از ماده ژنتیکی موجود زنده را برای شناسایی تولید کند ، به عنوان مثال ، این روش می تواند زودتر از تست استاندار ELISAویروس ایدز را در هفته های نخست عفونت تشخیص دهد .

PCRبلافاصله به دنبال DNAمخصوص ویروس می گردد . این کار درست برخلاف روشی است که در تست استاندارد بکار می رود یعنی تست استاندارد به جای جستجوی مستقیم DNA ویروس به دنبال شواهد غیر مستقیم آن ویروس که با جستجوی آنتی بادیهاییکه در بدن برعلیه آن ساخته می شوند ، می گردد .

روش PCRهمچنین بسیار دقیق تر از روش تست استاندارد است . به عنوان مثال در یکی از اتفاقات ناگوار دوران کودکی که عفونت گوش میانی است و ورم شامه مخاطی متوسط نامیده می شود و بسیار دردناک ، جدی و سرسخت است تغییرات جدی بوجود می آید . این تکنیک به دنبال DNA- ی باکتریایی در مایع گوش میانی کودک می گردد و خبر از عفونت فعال می دهد حتی زمانیکه روشهای کشت در جستجوی آن ناتوان باشند . در بیماری عفونی ، التهاب دردناک مفصلی که از طریق گاز کنه و انتقال باکتری ایجاد می شود ؛ معمولا بر اساس گروهی از علائم شناسایی می شوند . ولی PCRبر روی DNA- ی عامل بیماری که در مایع مفصلی وجود دارد متمرکز می شود و باعث بهبودی سریع شده و از پیچیدگیهای  جدی بعدی بیماری جلوگیری می کند .

PCRیک روش حساس و ویژه برای تست هلیکوباکترپیلوری است ، یک عامل بیماری که امروزه به عنوان عامل اصلی زخم معده شناخته شده است . برخلاف تستهای قبلی ، PCR می تواند سه عامل بیماری راکه از طریق جنسی توسط یک مجرا منتقل می شوند نظیر ( تب خال ، زگیل های ویروسی و کلامیدیا )شناسایی کند و حتی می تواند شاخه خاصی از زگیل ویروسی راکه منجر به سرطان میشود تشخیص دهد که سایر تستها قادر به شناسایی آنها نیستند .

بطور خلاصه ، اگر یک اختلال توسط عضو عفونی ایجاد شود ، بطور اساسی PCR می تواند عامل بیماری را بیرون براند . بیشتر از 60 مقاله PCRبرای تشخیص پاتوژنها  تا امروز منتشر شده است و حداقل 10 محصول کلینیکی برای شناسایی عوامل مجازی بیماری در بیماریهایی مانند سل ، کلامیدیا ، مننژیت های ویروسی ، ایدز و زگیلهای ویروسی قابل استفاده هستند . از آنجا که PCRمی تواند به آسانی تغییرات کوچک در DNA را که هر یک از ما داریم و از لحاظ ژنتیکی مارا منحصر به فرد میکند شناسایی کند این روش منجر به ایجاد روشهای نوین در آزمایشهای ژنتیک شده است . این تستها نه تنها افرادی که اختلا لات ارثی دارند را شناسایی میکنند بلکه افرادی که ناقل گونه های زیان آور که با نام دگرگونی شناخته میشوند و میتوانند به فرزندان آنها انتقال یابند را نیز شناسایی میکند . معمولا خود این افراد ناقل توسط ژنهای دگرگون شده مبتلا نمی شوند ولی این ژنها منجر به بیماری در نسلهای بعدی آنها میشوند .

انتظار می رود که تحقیقات منجر به تستهای پیشگویانه شوند : روشهایی برای فهم اینکه چه کسی مستعد اختلا لات رایجی است که به طور معمول ما آنها را ژنتیکی محسوب نمی کنیم مانند بیماریهای قلبی و سرطانهایی که در بزرگسالی به دلیل تغییر در سلولهای بدن بوجود می آیند . این دانش به ما کمک خواهد کرد که قدمهایی را برای جلوگیری از این بیماریها که از عوامل اصلی  مرگ و میر در دنیای امروز است ، برداریم . با تجزیه PCR در سلولهایی که در مدفوع پراکنده شده اند ، به عنوان مثال ، پزشکان قادر شده اند که تغییرات زیان آور در مسیر معده و روده نظیر دگرگونی در ژنهایی که بدن را در مقابل ایجاد تومورها و ورمها محافظت می کنند شناسائی کنند . این امر می تواند به آنها کمک کند تا داوطلبانی را که احتمال خطر سرطان کلون بالایی دارند را به راحتی انتخاب کنند . محققان همچنین سلولهای مستعد ناقل بیماری در دوره بیماری افراد بیماری که تومورها اخیرا در آنهاتشخیص داده شده بودند را شناسایی کردند .

PCR می تواند آرامش خاطر بزرگی باشد برای کسانی که تلاش برای بچه دار شدن دارند ، به عنوان مثال می توان به پدر و مادرهای آینده که نگران هستند این اطمینان را داد که هیچ خطری در مورد به دنیا آمدن فرزندی که مبتلا به بیماری ژنتیکی خاصی است آنها را تهدید نمی کند . این روش حتی زندگی نوزادان را قبل از اینکه دنیا بیایند نجات میدهد .

پزشکان ازاین شیوه برای آزمایش DNA – ی جنین جهت شناسایی اینکه گروههای خونی مادر و جنین ناسازگار هستند یا نه استفاده می کنند . این روش اغلب منجر به ناتوانی جسمی و حتی مرگ جنین میشود ولی به برکت PCR میتوان به صورت موفقیت آمیزی در رحم توسط پیشرفتهای پزشکی این مشکلات رابرطرف کرد .

این مراحل یک روش مستقیم هست برای تشخیص آشفتگی میان دگرگونی های مختلف میان یک ژن ، که هر کدام منجر به یک اختلال مثل سوء تغذیه ماهیچه ای دوشن میشوند . همچنین این مراحل به پزشکان کمک میکنند تا وجود یا عدم وجود مشخصات غیر عادی را در سرطانهای مخصوص تشخیص دهند ، بنابراین آنها می توانند درمانهای دارویی واصلا حات رادیولوژیکی  را هر چه زودتر که ممکن است شروع کنند یا قطع کنند . و این روش سازگاری ژنتیکی  چشمگیری را بین پیوند مغز استخوان فرد دهنده و گیرنده تضمین می کند .

PCR حتی می تواند در تشخیص بیماریهای گذشته افراد به کار گرفته شود . نائب رئیس پیشین و کاندیدای ریاست جمهوری هابرت اچ . هامفری در سال 1967آزمایشهائی را برای سرطان مثانه انجام داد .  اگر چه تستها منفی بودند ولی او در سال  1978 براثر بیماری درگذشت . در سال 1994 ، محققان نمونه بافتی را که آنها در سال 1976 از مثانه سرطانی او گرفته بودند با نمونه ادراری او در سال 1967 مقایسه کردند به کمک گسترش PCR مقادیر کوچک DNA در نمونه برداری 27 ساله آنها دگرگونیهای یکسانی در ژن P53 پیدا کردند که در متوقف کردن تومورها در هر دو نمونه یکسان هستند . طبق گفته محققین اگر آزمایش هامفری در سال 1967 توسط تکنیکهای زیست مولکولی بررسی میشدند  می توانستند رشد سرطانی را آشکار کنند ولی این روشها آنچنانکه امروز شناخته شده اند در آن زمان شناخته شده نبودند .

ژنتیک پزشکی تاریخی توسط  PCR حتی به زمانهای خیلی دور بر میگردد . بعد از اینکه شیمیدان انگلیسی کورنگ جان دالتون در سال 1844 در گذشت مقداری بافت از چشمهای او نگهداری شد . دالتون خواستار یک بررسی پس از مرگ شده بود تا دلیل اینکه چرا رنگ قرمز را با سبز و صورتی را با آبی اشتباه می گرفت . یک آزمایش جدید که از DNA آن بافت گرفته شده توسط PCR به دقت پرورش داده شد و نشان داد که دالتون ژن مخصوص که برای ساختن سه ماده رنگی لازم برای دید رنگی عادی لازم بود نداشت . بیشتر تستهای جدیدژنتیکی نتیجه پروژه ژنوم انسانی هستندکه یک تلاش بزرگ بین المللی برای شناسایی و مطالعه ژنهای انسانی هستند . دانشمندان انتظار دارند که پروژه ژنوم انسانی تا قبل از پایان ترم به زودی تمام شود . نسبت به هدف اصلی تعیین شده برای دستیابی به هدف نهایی اش ، این پروژه بسیار سریع حرکت میکند  که تمام DNA ها را در سلولهای انسانی نمونه به صورت زنجیره در می آورد  زنجیره به معنی مشخص کردن ترتیب چهار نوکلئوتید مختلف هستند که هر رشته از DNA را ایجاد میکنند .

به صورت رشته ای درآمدن DNA تغییرات حیاتی رادر نوکلئوتیدهایی که ژنها را تشکیل می دهند ، ایجاد میکنند . این تغییرات با وادار کردن ژنها به تولید پروتیین های غیر عادی منجر به بیماری و حتی مرگ میشود . به رشته در آمدن DNA ها ابتدا شامل جدا کردن و دو برابر کردن اجزای DNA برای بررسی های نوکلئوتیدی می باشد . بنابراین PCR  یک وسیله ضروری برای پروژه ژنوم انسانی است چرا که به آسانی و به سرعت می تواند مقادیر نامحدودی از هر تکه از DNA را برای این نوع تحقیق تولید کند

+ نوشته شده در  شنبه بیست و سوم مهر 1390ساعت 10:11  توسط نادر شهبازی  |